肝細胞癌（HCC）是全球第四大癌癥死亡原因，致死率極高。當前針對晚期HCC的治療方法，主要靶向腫瘤免疫微環(huán)境（TIME），而非直接針對腫瘤細胞。前期的研究表明異常的ac4C（N4-乙酰胞苷）修飾與多種實體瘤的進展有關，但是，ac4C在HCC進展中明確的生物學意義和關鍵的機制仍然是個謎。2024年7月，武漢同濟醫(yī)院張必翔團隊一篇題為“Targeting N4-acetylcytidine suppresses hepatocellular carcinoma progression by repressing eEF2-mediated HMGB2 mRNA translation”的研究成果發(fā)表在Cancer Communications期刊上，該研究揭示了NAT10-ac4C/eEF2-HMGB2表觀轉(zhuǎn)錄組軸在調(diào)節(jié)HCC生長和轉(zhuǎn)移中的關鍵作用，且驗證了帕比司他（Panobinostat）是針對NAT10介導的ac4C的一種有效且安全的先導化合物，具有潛在的肝癌治療價值。

邁維代謝為該研究提供了RNA甲基化靶向代謝組學檢測！

研究方法

組學方法：ac4C靶向檢測、轉(zhuǎn)錄組測序、acRIP-seq、DIA定量蛋白組檢測等；

其他方法：qRT-PCR、Western blot分析、細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)導、免疫組化(IHC)檢測等；

研究結果

1.RNA ac4C高乙酰化和NAT10上調(diào)與肝癌預后不良相關

為了闡明ac4C修飾在肝細胞癌（HCC）中的功能作用，研究人員檢測了20例HCC組織和癌旁組織中RNA ac4C 的水平。點印跡（Dot blot）實驗顯示，HCC組織總RNA中ac4C水平顯著升高（圖1A）。這一發(fā)現(xiàn)通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）RNA甲基化靶向代謝組分析進一步得到證實，該分析顯示HCC組織mRNA中ac4C水平顯著升高（圖1B）。比較了20對HCC和正常肝組織中NAT10（負責ac4C修飾的唯一乙酰轉(zhuǎn)移酶）的mRNA水平，結果表明NAT10在HCC中顯著上調(diào)，并且在20例HCC組織中NAT10表達與 RNA ac4C水平之間存在顯著相關性。為了進一步驗證這些結果，研究人員對來自89組HCC患者的數(shù)據(jù)進行了大規(guī)模數(shù)據(jù)挖掘分析。其中62個隊列內(nèi)mRNA NAT10 水平有顯著變化。54個隊列HCC組織中mRNA NAT10 水平顯著升高（圖1C）。接下來，使用來自臨床蛋白質(zhì)組學腫瘤分析聯(lián)盟（CPTAC）的數(shù)據(jù)集進行了基因表達分析，該數(shù)據(jù)集支持NAT10在HCC中的上調(diào)（圖1D）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，通過蛋白質(zhì)印跡法分析，人HCC組織中NAT10的蛋白質(zhì)水平顯著高于癌旁組織（圖1E）。對來自HCC組織微陣列（同濟隊列）的103對樣本的免疫組織化學分析，進一步證實了HCC樣本中NAT10的上調(diào)（圖1F）。此外，NAT10的高表達與HCC患者的總生存期和無復發(fā)生存期顯著縮短有關（圖1G）。

后續(xù)分析表明，NAT10高表達與患者HCC組織和與不良預后相關的分子亞型iCluster-1 HCC樣本中的臨床晚期顯著相關。NAT10表達在HCC發(fā)展過程中逐漸增加（圖1H）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明NAT10表達與HCC的惡性進展密切相關。

圖1.在HCC患者中，NAT10表達升高與預后不良相關

2.下調(diào)NAT10可抑制HCC的增殖和轉(zhuǎn)移

為了研究NAT10在肝細胞癌（HCC）中的功能，研究人員使用NAT10表達和ac4C修飾水平均升高的細胞系（MHCC-97H和SNU449）建立了穩(wěn)定的NAT10敲低細胞系。與對照shRNA（shCtrl）相比，NAT10的敲低顯著降低了總RNA和mRNA中的ac4C含量（圖2A）。NAT10沉默顯著抑制了HCC細胞的活力（圖2B-C）、克隆形成能力（圖2D）以及軟瓊脂菌落形成效率（圖2E）。此外，傷口愈合遷移、Transwell遷移和基質(zhì)膠侵襲實驗表明，NAT10沉默顯著抑制了MHCC-97H和SNU449細胞的遷移和侵襲能力（圖2F-G）。隨后，研究人員評估了NAT10在體內(nèi)對HCC增殖和轉(zhuǎn)移的影響。腫瘤異種移植研究表明，NAT10沉默顯著抑制了腫瘤生長，表現(xiàn)為與對照細胞來源的腫瘤相比，腫瘤大小和重量減少（圖2H）。此外，腫瘤異種移植中NAT10的敲低導致細胞增殖受到抑制并誘導凋亡，這分別通過Ki-67和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標記（TUNEL）染色得到證實（圖2I-J）。此外，在肝臟原位植入模型中，與對照組相比，接種NAT10敲低細胞的組肝內(nèi)腫瘤結節(jié)的體積和數(shù)量顯著減少（圖2K）。此外，在通過向裸鼠的側(cè)尾靜脈注射NAT10敲低細胞和陰性對照細胞建立的肺轉(zhuǎn)移模型中，NAT10沉默顯著抑制了HCC的肺轉(zhuǎn)移（圖2L）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明NAT10在HCC的增殖和轉(zhuǎn)移中作為致癌驅(qū)動因子發(fā)揮著關鍵作用。

圖2.在體外和體內(nèi)，NAT10敲低抑制HCC進展

3.NAT10對mRNA ac4C修飾和全局mRNA翻譯的影響

分別對NAT10敲除和不敲除的MHCC-97H細胞中進行了acRIP-seq實驗（圖3A）。確定了對照組細胞中來自4784個ac4C修飾的轉(zhuǎn)錄本的共11591個ac4C峰，以及NAT10缺陷細胞中來自691個ac4C修飾的轉(zhuǎn)錄本的3148個峰（圖3B-C）。值得注意的是，在穩(wěn)定的NAT10敲除細胞中出現(xiàn)了609個新的峰，而9052個峰消失了（圖3B）。由于NAT10是一種ac4C乙酰轉(zhuǎn)移酶，因此這9052個獨特的峰預計包含NAT10的真正靶標。在檢測到的峰中富集了ac4C共有基序“CXX”（圖3D），這與先前的研究結果一致。隨后，研究人員比較了有或沒有shNAT10的HCC細胞中的acRIP-seq數(shù)據(jù)，分析了差異ac4C峰及其對應的轉(zhuǎn)錄本。在shNAT10細胞中鑒定出125個轉(zhuǎn)錄本顯示出ac4C峰減少（圖3F），這些結果共同表明NAT10在HCC中介導ac4C mRNA乙酰化。通過RNAseq和Ribo-seq實驗，鑒定受NAT10介導的ac4C修飾影響的下游功能效應子（圖3G）。NAT10的耗竭極大地改變了基因轉(zhuǎn)錄表達和核糖體保護片段（RPF）的豐度（圖3H）。從RNA-seq中，在NAT10耗竭后檢測到635個下調(diào)和818個上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。從Ribo-Seq中，NAT10敲低后鑒定出277個下調(diào)和332個上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。mRNAs ac4C（-）在響應NAT10缺失時顯示出特定的T.E（翻譯效率）升高（圖3I）。多聚體分析顯示，在NAT10缺陷細胞中，80S單體和多聚體的組裝顯著減少（圖3J），表明NAT10的耗竭抑制了全局蛋白質(zhì)翻譯。此外，使用SUnSET試驗測定時，NAT10的耗竭顯著抑制了蛋白質(zhì)合成（圖3K）。所有這些結果表明NAT10介導的mRNA ac4C修飾增強了肝細胞癌中的全局翻譯效率。

圖3.NAT10對mRNA ac4c修飾和全局mRNA翻譯的影響

4.NAT10介導的ac4C修飾增強HMGB2 mRNA的翻譯

研究人員將來自acRIP-seq、RNA-seq和Ribo-seq的重疊候選基因進行重疊，以精確定位下游靶標（圖4A）。在潛在的NAT10下游靶標（HMGB2、HIF0、PITX1和STC2）中，HMGB2在NAT10耗竭后顯示出最顯著的下調(diào)（圖4B-C），這表明HMGB2可能是HCC細胞中NAT10的直接靶標。acRIP-seq和Ribo-seq數(shù)據(jù)顯示，在NAT10缺陷細胞中，CDS中的ac4C富集和核糖體占據(jù)率顯著降低（圖4D）。相應地，NAT10敲低顯著降低了HMGB2 mRNA的ac4C水平和蛋白質(zhì)表達（圖4E-F），而其mRNA豐度未受影響。有趣的是，使用MG132抑制蛋白酶體未能恢復NAT10沉默的HCC細胞中HMGB2的蛋白質(zhì)表達（圖4G），這表明NAT10誘導的HMGB2表達不受蛋白質(zhì)降解變化的影響。將HMGB2 CDS連接到多克隆位點（MCS）來構建了pmirGLO-HMGB2熒光素酶報告基因，雙熒光素酶測定清楚地表明，與對照細胞相比，NAT10缺陷細胞中HMGB2的翻譯效率顯著降低（圖4H，補充圖S4B-C）。此外，與對照細胞相比，NAT10缺陷細胞中HMGB2 mRNA在核糖體組分中的分布顯示翻譯活性多聚體（> 80S）顯著減少（圖4I）。這些綜合結果表明，ac4C誘導的HMGB2表達與翻譯調(diào)控有關。

在NAT10敲低細胞中過表達HMGB2顯著恢復了細胞的體外增殖和侵襲能力。此外，體內(nèi)實驗表明，HMGB2完全挽救了NAT10敲低后的異種移植瘤生長和肺轉(zhuǎn)移（圖4J-L）。該數(shù)據(jù)表明，HMGB2是NAT10的關鍵功能性靶標。此外，在同濟醫(yī)院和CPTAC隊列中分析了HMGB2的臨床相關性，揭示了HCC組織中HMGB2的表達升高。相關性分析進一步揭示了HCC中高表達的HMGB2與NAT10水平之間存在顯著關聯(lián)（圖4M-N）。此外，生存分析表明，這兩個基因的高表達均預示著最差的總體生存期（OS）和無復發(fā)生存期（RFS）。綜上所述，NAT10介導的ac4C修飾通過增強HMGB2的翻譯促進了HCC的惡性進展。

圖4.ac4C的修飾增強了HMGB2的翻譯

5.HMGB2 mRNA的CDS ac4C位點增強eEF2的結合

RNA的乙酰化也可能影響相互作用蛋白的結合，這與特異性結合蛋白通過介導mRNA翻譯來識別RNA中的N6-甲基腺苷相似。為了鑒定直接結合ac4C修飾的蛋白質(zhì)，研究人員使用含有或不含ac4C的生物素標記寡核苷酸進行了RNA親和色譜法和數(shù)據(jù)非依賴性采集（DIA）蛋白質(zhì)組學定量檢測（圖5A-B）。結果，在ss-ac4C組中，檢測到123種蛋白質(zhì)。GO分析表明，蛋白質(zhì)主要富集在翻譯延伸和翻譯等方面（圖5C）。此外，還在STRING蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）數(shù)據(jù)庫中搜索了這些鑒定出的蛋白質(zhì)，以查找已知的PPI，并根據(jù)通過GO分析獲得的已知功能對蛋白質(zhì)節(jié)點進行了分組。根據(jù)這些蛋白質(zhì)已知的生物學功能，將它們分為六個主要亞群，包括翻譯、靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖核蛋白等。所有這些結果都表明，ac4C修飾參與了翻譯過程。對ss-ac4C和acFUS結合蛋白進行重疊分析，鑒定出了eEF2和SRP68（圖5D-E）。RNA下拉實驗證實，eEF2和SRP68優(yōu)先結合ac4C修飾的寡核苷酸（圖5F）。隨后，為了確定eEF2或SRP68是否參與HMGB2翻譯的調(diào)控，首先通過瞬時siRNA介導的eEF2和SRP68敲低來評估HMGB2的表達。結果發(fā)現(xiàn)，eEF2敲低后HMGB2蛋白顯著下調(diào)。此外，RNA下拉實驗進一步證實，eEF2確實對ac4C修飾的RNA顯示出更高的結合能力（圖5G）。這表明eEF2是ac4C乙酰化mRNA的特異性結合蛋白。此外，內(nèi)源性eEF2的RNA免疫沉淀（RIP）顯示，eEF2結合的RNA中ac4C修飾顯著富集。此外，NAT10的耗竭相應減少了eEF2在80S核糖體和多核糖體中的分布，這支持了eEF2作為ac4C識別器的觀點。為了驗證eEF2是否參與HMGB2 mRNA的ac4C乙酰化，使用RIP-qPCR研究了HMGB2 mRNA與eEF2之間的相互作用。數(shù)據(jù)顯示，eEF2在HMGB2 mRNA中顯著富集，而在NAT10缺陷細胞中，這種相對富集被顯著抑制（圖5H）。NAT10的過表達導致HMGB2蛋白表達上調(diào)，而eEF2敲低后這種上調(diào)被顯著減弱。這些發(fā)現(xiàn)表明eEF2參與了ac4C修飾調(diào)控的HMGB2表達。

使用ac4C抗體對有無NAT10缺陷的肝癌細胞中的片段化RNA進行了免疫沉淀（圖5J）。結果表明，ac4C主要富集在HMGB2的外顯子1/2/3和5′UTR，而不是3′UTR。有趣的是，NAT10缺陷細胞中，外顯子2、外顯子3和5′UTR的ac4C富集顯著降低，而外顯子1則沒有觀察到類似效應（圖5J）。HMGB2 5′UTR-報告基因熒光素酶測定結果顯示，對于野生型和突變型5′UTR構建體，NAT10缺陷細胞與對照組之間在翻譯上沒有顯著差異。研究人員構建了一個僅包含野生型HMGB2 CDS的表達構建體，以及在CXX富集區(qū)引入C到T的突變，構建了三種突變型HMGB2 CDS變體（突變體1/2/3），在所有三種突變體中，HMGB2蛋白水平幾乎完全恢復（圖5K）。相應地突變了pmirGLO-HMGB2熒光素酶報告基因，并進行了雙熒光素酶測定，結果顯示，所有三種突變體都減弱了NAT10對HMGB2翻譯的抑制作用（圖5L），這表明HMGB2外顯子2和外顯子3中的乙酰化是ac4C調(diào)控HMGB2 mRNA翻譯的關鍵位點。為了驗證eEF2是否參與HMGB2 mRNA中已確定的三個ac4C乙酰化位點，進行了RNA免疫沉淀-定量PCR（RIP-qPCR）來探究HMGB2 mRNA與eEF2之間的相互作用。RIP-PCR的結果顯示，eEF2主要與HMGB2 mRNA中已確定的乙酰化CDS區(qū)域相互作用，而不是5′UTR區(qū)域（圖5M）。這一相互作用通過RNA下拉實驗得到了進一步證實，該實驗驗證了eEF2與HMGB2乙酰化CDS區(qū)域的結合（圖5N）。這些數(shù)據(jù)強烈表明，eEF2可能是肝癌細胞中ac4C誘導的HMGB2 mRNA翻譯的關鍵因子。

圖5.HMGB2 mRNA的CDS ac4C位點增強了eEF2的結合

6.帕比司他（Panobinostat）作為NAT10介導的ac4C抑制劑的鑒定與表征

研究人員構建了表達野生型NAT10或其催化突變體（G641E）的質(zhì)粒，已知該突變體會損害NAT10的RNA乙酰轉(zhuǎn)移酶功能。分析結果顯示，與野生型細胞相比，催化突變體NAT10的細胞中ac4C水平顯著降低（圖6A）。重要的是，研究人員發(fā)現(xiàn)NAT10的ac4C催化活性域（G641）對于其促進HCC細胞增殖和侵襲的作用至關重要。此外，催化突變體NAT10的過表達顯著抑制了蛋白質(zhì)合成。同時，催化突變體NAT10的過表達對HMGB2蛋白水平或mRNA ac4C水平?jīng)]有影響（圖6A）。研究人員基于結構的虛擬篩選、NAT10的催化口袋、抗腫瘤活性等方法選擇了帕比司他作為NAT10抑制劑（圖6B）。對接模型表明，帕比司他緊密結合NAT10蛋白并阻斷其催化口袋（圖6C）。隨后，表面等離子共振分析（圖6D）顯示帕比司他與NAT10之間具有高親和力（KD = 8.544 μM）。此外，帕比司他處理導致NAT10蛋白的熱穩(wěn)定性發(fā)生顯著變化（圖6E），表明其能夠與NAT10結合。藥物親和力響應靶標穩(wěn)定性（DARTS）試驗進一步證實了它們之間的直接相互作用（圖6F）。點印跡分析表明，帕比司他處理以劑量依賴的方式顯著降低了總RNA和mRNA中的全局ac4C豐度（圖6G-H）。此外，帕比司他處理顯著抑制了蛋白質(zhì)合成并抑制了HMGB2的表達（圖6I）。而且，帕比司他在肝細胞癌細胞中導致HMGB2 mRNA的ac4C水平（圖6J）和HMGB2翻譯效率（圖6K）顯著降低。此外，富含在HMGB2 mRNA中的eEF2在帕比司他處理的細胞中受到顯著抑制（圖6L）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，帕比司他表現(xiàn)出對NAT10催化口袋的選擇性結合和占據(jù)，從而抑制靶標RNA轉(zhuǎn)錄本中的ac4C修飾。

圖6.NAT10抑制劑帕比司他（panobinostat）的特征

7.帕比司他在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出抗肝癌活性

帕比司他顯示出對MHCC-97H細胞生長的劑量依賴性抑制作用（圖7A），其半數(shù)抑制濃度（IC50）為4.469 nmol/L。與NAT10敲低一致，帕比司他顯著抑制了細胞增殖和侵襲（圖7B-C）。隨后，體內(nèi)評估了帕比司他的抗肝癌作用（圖7D），發(fā)現(xiàn)其并未引起體重減輕。在皮下異種移植模型中，帕比司他以劑量依賴的方式有效抑制了異種移植腫瘤的生長（圖7E）。為了進一步驗證NAT10介導的ac4C在體內(nèi)的抑制作用，研究人員分別使用點雜交和Western blot檢測了經(jīng)帕比司他處理和對照小鼠異種移植腫瘤組織中的RNA ac4C水平和HMGB2蛋白表達。與對照小鼠相比，經(jīng)帕比司他處理的小鼠RNA中的ac4C水平顯著降低（圖7F）。此外，帕比司他有效抑制了小鼠體內(nèi)HMGB2的蛋白表達（圖7G）。組織病理學檢查進一步證實了帕比司他的療效，表明其對體內(nèi)NAT10和HMGB2表達的抑制作用（圖7H）。此外，與對照組相比，經(jīng)帕比司他處理的組肝內(nèi)腫瘤結節(jié)的體積和數(shù)量均顯著減少（圖7I）。值得注意的是，與對照組相比，生物發(fā)光成像和肺轉(zhuǎn)移病灶定量結果表明，帕比司他治療顯著抑制了肝癌細胞的肺轉(zhuǎn)移（圖7J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明帕比司他是針對NAT10介導的ac4C的一種有效且安全的先導化合物，具有潛在的肝癌治療價值。

圖7.帕比司他在體外和體內(nèi)均顯示出良好的抗HCC療效

研究結論

該研究確定了NAT10介導的ac4C修飾觸發(fā)了肝癌（HCC）中HMGB2的異常上調(diào)。作為NAT10的功能靶點，它刺激HMGB2 mRNA編碼序列（CDS）內(nèi)的ac4C修飾，從而增強HMGB2的翻譯。此外，該研究還揭示了eEF2作為ac4C修飾mRNA的新型閱讀器，展示了其與HMGB2 mRNA CDS內(nèi)ac4C位點的結合并促進HMGB2的翻譯。值得注意的是，該研究已經(jīng)確定了帕比司他作為一種強效的NAT10-ac4C抑制劑，可有效阻止肝癌的進展。綜上所述，該研究闡明了NAT10介導的mRNA ac4C修飾在肝癌發(fā)展中的關鍵作用，并強調(diào)了NAT10/ac4C作為肝癌治療靶點的治療潛力。