全球變暖通過降低作物生產(chǎn)力和質(zhì)量嚴(yán)重威脅全世界糧食安全。據(jù)預(yù)測(cè)，每超過最適溫度1°C，小麥產(chǎn)量將下降約6%，而且在過去三十年中，熱應(yīng)激已導(dǎo)致全球小麥產(chǎn)量減少5.5%。印度矮小麥（Triticum sphaerococcum）對(duì)環(huán)境適應(yīng)性增強(qiáng)，然而其耐熱性潛在機(jī)制在很大程度上還是未知的。揭示控制印度矮小麥耐熱性關(guān)鍵基因并解讀它們相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于探索這種種質(zhì)以提高作物耐熱性具有重要意義。

2023年3月7日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究中心孫其信院士、辛明明教授在Nature Communications發(fā)表文章“Natural variation of STKc_GSK3 kinase TaSG-D1 contributes to heat stress tolerance in Indian dwarf wheat”，文中鑒定了印度矮小麥中耐熱基因TaSG-D1E286K，并通過磷酸化蛋白組揭示其如何增強(qiáng)耐熱性。

主要結(jié)論：

1.小麥耐熱基因TaSG-D1E286K鑒定

印度矮小麥T. sphaerococcum導(dǎo)入系ND4332在熱應(yīng)激條件下比普通小麥T. aestivum導(dǎo)入系HS2具有更高耐熱性，幼苗存活率分別為78.3%和5.7%。而后使用ND4332和HS2生成F7重組自交系（RIL）群體進(jìn)行QTL定位，鑒定了兩個(gè)與耐熱性相關(guān)的候選QTL，分別位于3D染色體和5A染色體上。其中3D染色體ND4332衍生等位基因TaSG-D1突變E286K（TaSG-D1E286K）提高耐熱性，并解釋11.7%表型變異。文中在TaSG-D1E286K近等基因系、五種攜帶TaSG-D1E286K等位基因的印度矮小麥、TaSG-D1E286K功能喪失品系、TaSG-D1過表達(dá)品系、成熟階段進(jìn)近等基因系等行了驗(yàn)證，綜合結(jié)果表明，TaSG-D1中E286K突變是印度矮小麥提高耐熱性的原因。

TaSG-D1E286K調(diào)控印度矮稈小麥的耐熱性

2.TaSG-D1E286K通過調(diào)節(jié)TaPIF4賦予熱耐受性

為闡明TaSG-D1E286K/TaSG-D1對(duì)熱應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，文中通過酵母雙雜交(Y2H)實(shí)驗(yàn)，篩選與TaSG-D1E286K/TaSG-D1相互作用蛋白質(zhì)TaPIF4（TraesCS5B02G380200）。截?cái)喾治龃_認(rèn)TaPIF4的C末端負(fù)責(zé)與TaSG-D1和TaSG-D1E286K相互作用，并進(jìn)一步通過熒光素酶互補(bǔ)成像（LCI）、Pull-down和Co-IP驗(yàn)證。并通過CRISPR-Cas9技術(shù)表面TaPIF4基因敲除突變體展現(xiàn)出較差熱耐受性。

TaSG-D1和TaSG-D1E286K與TaPIF4相互作用

對(duì)正常條件和熱應(yīng)激條件（42°C處理3h和6h）TaPIF4敲除品系Tapif4-7（Tapif4-KO）和野生型進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以確定TaPIF4依賴的熱響應(yīng)基因。Tapif4-KO品系0h、3h和6h共有2289、4981和7278個(gè)基因下調(diào)。GO富集分析顯示，0h下調(diào)基因主要涉及光合作用，3h和6h下調(diào)基因主要富集在與“熱響應(yīng)”、“蛋白質(zhì)折疊”和“活性氧響應(yīng)”相關(guān)條目。

3.TaSG-D1E286K增強(qiáng)TaPIF4蛋白穩(wěn)定性

由于TaSG-D1E286K和TaSG-D1都是蛋白激酶，文中進(jìn)行了體外磷酸化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白都觸發(fā)了TaPIF4磷酸化。LC-MS/MS分析鑒定了14個(gè)TaPIF4磷酸化位點(diǎn)，14個(gè)位點(diǎn)由TaSG-D1介導(dǎo)磷酸化。TaPIF4D（磷酸化形式TaPIF4）在熱應(yīng)激下穩(wěn)定性比TaPIF4更強(qiáng)，相比之下，TaPIF4A（TaPIF4非磷酸化形式）在熱應(yīng)激條件下蛋白穩(wěn)定性比TaPIF4降低。為驗(yàn)證磷酸化形式TaPIF4生物學(xué)意義，在小麥中過表達(dá)了TaPIF4D，觀察到TaPIF4D過表達(dá)品系在熱應(yīng)激條件下展現(xiàn)出更強(qiáng)的耐熱性。

文中驗(yàn)證了E286K替換是否影響TaSG-D1E286K/TaSG-D1蛋白穩(wěn)定性，TaSG-D1在熱應(yīng)激下逐漸降解，而TaSG-D1E286K蛋白豐度表現(xiàn)出較低降解水平。此外，與TaSG-D1相比，TaSG-D1E286K與TaPIF4相互作用更強(qiáng)，致使TaPIF4磷酸化水平增加且熱應(yīng)激下蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)。不同時(shí)間周期無細(xì)胞降解測(cè)定證明在正常和熱應(yīng)激條件下，TaSG-D1E286K蛋白溶液中TaPIF4的降解速率低。總的來說，在印度和巴基斯坦高溫地區(qū)，TaSG-D1E286K蛋白表現(xiàn)出對(duì)熱應(yīng)激的弱降解性，E286K突變使其與TaPIF4相互作用增強(qiáng)，磷酸化并穩(wěn)定TaPIF4，因此在熱應(yīng)激條件下提高了耐熱性；而在普通小麥中，TaSG-D1蛋白在熱應(yīng)激下不穩(wěn)定，與TaPIF4的相互作用較弱，導(dǎo)致TaPIF4的磷酸化減少和降解增加，從而使熱耐受性降低。

TaSG-D1和TaSG-D1E286K對(duì)TaPIF4蛋白穩(wěn)定性的不同影響

4.TaSG-D1和TaPIF4基因組差異分析

為更好理解TaSG-D1E286K等位基因在小麥育種中利用情況，根據(jù)已發(fā)布重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明E286K變異僅限于印度和巴基斯坦T. sphaerococcum小麥，且TaSG-D1啟動(dòng)子序列是保守的。FST分析確定了現(xiàn)代品種和中國地方品種TaPIF4基因存在差異區(qū)域（549.0 Mb–574.0 Mb），在中國現(xiàn)代品種TaPIF4啟動(dòng)子發(fā)生了InDels。為探索與熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)TaPIF4表達(dá)水平自然變異，使用PlantCare分析了2-kb啟動(dòng)子序列，并鑒定了12個(gè)保守的脅迫響應(yīng)元素，1909-bp插入、405-bp缺失、12-bp和275-bp缺失導(dǎo)致在熱應(yīng)激反應(yīng)中LUC/REN活性顯著降低，這表明中國現(xiàn)代品種中人工選擇的TaPIF4啟動(dòng)子單倍型不利于耐熱性改善。

我國小麥選擇育種過程中TaPIF4人工選擇足跡

文章小結(jié)

本研究在小麥中鑒定了一個(gè)耐熱基因TaSG-D1E286K，并闡明了其響應(yīng)熱脅迫的分子網(wǎng)絡(luò)，主要通過增強(qiáng)下游靶點(diǎn)TaPIF4在熱應(yīng)激條件下磷酸化水平和穩(wěn)定性，從而提高小麥耐熱性。這些發(fā)現(xiàn)不僅增強(qiáng)了對(duì)小麥耐熱性的理解，同時(shí)也為今后提高小麥的耐熱性提供了潛在的基因資源。

文中可見蛋白磷酸化在響應(yīng)植物脅迫中起重要作用，磷酸化通過介導(dǎo)受體激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而控制植物響應(yīng)生物或非生物脅迫，在植物不同過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。邁維代謝建立4D-label free磷酸化蛋白組檢測(cè)平臺(tái)，具有富集效率高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，有效保證磷酸化位點(diǎn)檢出數(shù)量。