全球變暖通過降低作物生產力和質量嚴重威脅全世界糧食安全。據預測，每超過最適溫度1°C，小麥產量將下降約6%，而且在過去三十年中，熱應激已導致全球小麥產量減少5.5%。印度矮小麥（Triticum sphaerococcum）對環境適應性增強，然而其耐熱性潛在機制在很大程度上還是未知的。揭示控制印度矮小麥耐熱性關鍵基因并解讀它們相關的調控網絡，對于探索這種種質以提高作物耐熱性具有重要意義。

2023年3月7日，中國農業大學小麥研究中心孫其信院士、辛明明教授在Nature Communications發表文章“Natural variation of STKc_GSK3 kinase TaSG-D1 contributes to heat stress tolerance in Indian dwarf wheat”，文中鑒定了印度矮小麥中耐熱基因TaSG-D1E286K，并通過磷酸化蛋白組揭示其如何增強耐熱性。

主要結論：

1.小麥耐熱基因TaSG-D1E286K鑒定

印度矮小麥T. sphaerococcum導入系ND4332在熱應激條件下比普通小麥T. aestivum導入系HS2具有更高耐熱性，幼苗存活率分別為78.3%和5.7%。而后使用ND4332和HS2生成F7重組自交系（RIL）群體進行QTL定位，鑒定了兩個與耐熱性相關的候選QTL，分別位于3D染色體和5A染色體上。其中3D染色體ND4332衍生等位基因TaSG-D1突變E286K（TaSG-D1E286K）提高耐熱性，并解釋11.7%表型變異。文中在TaSG-D1E286K近等基因系、五種攜帶TaSG-D1E286K等位基因的印度矮小麥、TaSG-D1E286K功能喪失品系、TaSG-D1過表達品系、成熟階段進近等基因系等行了驗證，綜合結果表明，TaSG-D1中E286K突變是印度矮小麥提高耐熱性的原因。

TaSG-D1E286K調控印度矮稈小麥的耐熱性

2.TaSG-D1E286K通過調節TaPIF4賦予熱耐受性

為闡明TaSG-D1E286K/TaSG-D1對熱應激調控機制，文中通過酵母雙雜交(Y2H)實驗，篩選與TaSG-D1E286K/TaSG-D1相互作用蛋白質TaPIF4（TraesCS5B02G380200）。截斷分析確認TaPIF4的C末端負責與TaSG-D1和TaSG-D1E286K相互作用，并進一步通過熒光素酶互補成像（LCI）、Pull-down和Co-IP驗證。并通過CRISPR-Cas9技術表面TaPIF4基因敲除突變體展現出較差熱耐受性。

TaSG-D1和TaSG-D1E286K與TaPIF4相互作用

對正常條件和熱應激條件（42°C處理3h和6h）TaPIF4敲除品系Tapif4-7（Tapif4-KO）和野生型進行轉錄組測序以確定TaPIF4依賴的熱響應基因。Tapif4-KO品系0h、3h和6h共有2289、4981和7278個基因下調。GO富集分析顯示，0h下調基因主要涉及光合作用，3h和6h下調基因主要富集在與“熱響應”、“蛋白質折疊”和“活性氧響應”相關條目。

3.TaSG-D1E286K增強TaPIF4蛋白穩定性

由于TaSG-D1E286K和TaSG-D1都是蛋白激酶，文中進行了體外磷酸化實驗，結果發現這兩種蛋白都觸發了TaPIF4磷酸化。LC-MS/MS分析鑒定了14個TaPIF4磷酸化位點，14個位點由TaSG-D1介導磷酸化。TaPIF4D（磷酸化形式TaPIF4）在熱應激下穩定性比TaPIF4更強，相比之下，TaPIF4A（TaPIF4非磷酸化形式）在熱應激條件下蛋白穩定性比TaPIF4降低。為驗證磷酸化形式TaPIF4生物學意義，在小麥中過表達了TaPIF4D，觀察到TaPIF4D過表達品系在熱應激條件下展現出更強的耐熱性。

文中驗證了E286K替換是否影響TaSG-D1E286K/TaSG-D1蛋白穩定性，TaSG-D1在熱應激下逐漸降解，而TaSG-D1E286K蛋白豐度表現出較低降解水平。此外，與TaSG-D1相比，TaSG-D1E286K與TaPIF4相互作用更強，致使TaPIF4磷酸化水平增加且熱應激下蛋白穩定性增強。不同時間周期無細胞降解測定證明在正常和熱應激條件下，TaSG-D1E286K蛋白溶液中TaPIF4的降解速率低。總的來說，在印度和巴基斯坦高溫地區，TaSG-D1E286K蛋白表現出對熱應激的弱降解性，E286K突變使其與TaPIF4相互作用增強，磷酸化并穩定TaPIF4，因此在熱應激條件下提高了耐熱性；而在普通小麥中，TaSG-D1蛋白在熱應激下不穩定，與TaPIF4的相互作用較弱，導致TaPIF4的磷酸化減少和降解增加，從而使熱耐受性降低。

TaSG-D1和TaSG-D1E286K對TaPIF4蛋白穩定性的不同影響

4.TaSG-D1和TaPIF4基因組差異分析

為更好理解TaSG-D1E286K等位基因在小麥育種中利用情況，根據已發布重測序數據進行了分析。結果表明E286K變異僅限于印度和巴基斯坦T. sphaerococcum小麥，且TaSG-D1啟動子序列是保守的。FST分析確定了現代品種和中國地方品種TaPIF4基因存在差異區域（549.0 Mb–574.0 Mb），在中國現代品種TaPIF4啟動子發生了InDels。為探索與熱應激反應相關TaPIF4表達水平自然變異，使用PlantCare分析了2-kb啟動子序列，并鑒定了12個保守的脅迫響應元素，1909-bp插入、405-bp缺失、12-bp和275-bp缺失導致在熱應激反應中LUC/REN活性顯著降低，這表明中國現代品種中人工選擇的TaPIF4啟動子單倍型不利于耐熱性改善。

我國小麥選擇育種過程中TaPIF4人工選擇足跡

文章小結

本研究在小麥中鑒定了一個耐熱基因TaSG-D1E286K，并闡明了其響應熱脅迫的分子網絡，主要通過增強下游靶點TaPIF4在熱應激條件下磷酸化水平和穩定性，從而提高小麥耐熱性。這些發現不僅增強了對小麥耐熱性的理解，同時也為今后提高小麥的耐熱性提供了潛在的基因資源。

文中可見蛋白磷酸化在響應植物脅迫中起重要作用，磷酸化通過介導受體激酶信號轉導從而控制植物響應生物或非生物脅迫，在植物不同過程中發揮關鍵作用。邁維代謝建立4D-label free磷酸化蛋白組檢測平臺，具有富集效率高、特異性好等優點，有效保證磷酸化位點檢出數量。