柑橘是世界最重要的水果作物屬之一，但許多柑橘品種對寒冷壓力敏感。宜昌橙（Citrus ichangensis），一種耐寒的柑橘品種，具有識別對柑橘耐寒性至關重要的有價值代謝物的巨大潛力。然而，調(diào)節(jié)宜昌橙耐寒性的代謝變化和潛在機制在很大程度上仍然未知。2024年6月14日，華中農(nóng)業(yè)大學果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國重點實驗室劉繼紅教授課題組在Plant Physiology上發(fā)表了題為“Transcriptome and metabolome atlas reveals contributions of sphingosine and chlorogenic acid to cold tolerance in Citrus”的研究論文，揭示了鞘氨醇和綠原酸在柑橘抗寒中的重要功能。

研究結(jié)果

1.與HB柚相比，宜昌橙具有更強的耐寒性

為了評估耐寒性，宜昌橙和HB柚子幼苗被進行了冷處理（-4℃，8小時）。八小時的冷脅迫后，與宜昌橙相比，HB柚子出現(xiàn)了嚴重的水浸和明顯的葉片萎蔫（圖1A）。Fv/Fm比率降低。相比之下，宜昌橙植物僅受到輕微的冷脅迫影響（圖1B，E）。冷脅迫后，宜昌橙植物的電解質(zhì)泄漏（EL）和丙二醛（MDA）水平顯著低于HB柚子，表明宜昌橙的細胞損傷較小（圖1C-D）。在冷處理后，宜昌橙中積累的ROS水平遠低于HB柚子（圖1F）。這些結(jié)果表明，與HB柚子相比，宜昌橙表現(xiàn)出了更高的耐寒性。

圖1 與HB柚相比，宜昌柚具有更強的耐寒性。

2.代謝組分析

為了探索宜昌橙和HB柚子在冷脅迫下與冷相關的代謝網(wǎng)絡的差異，對葉片進行了非靶代謝組分析。總共鑒定出512種代謝物，包括124種黃酮類化合物、69種酚酸、63種氨基酸及其衍生物、62種其他物質(zhì)種萜類化合物和1種單寧（圖2A）。相同時間點上，宜昌橙檢測到了更劇烈的變化。宜昌橙積累了顯著更高水平的黃酮類化合物、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、木脂素和香 豆素以及萜類化合物。主成分分析（PCA）顯示，512種代謝物可以根據(jù)每個物種分為兩組，與層次聚類分析一致（圖2B）。在冷處理后12小時（上調(diào)11種，下調(diào)19種）、24小時（上調(diào)19種，下調(diào)46種）和72小時（上調(diào)32種，下調(diào)42種）分別在HB中鑒定出30、65和74種DAMs（圖2C）。同樣，在宜昌橙在冷處理后12小時（上調(diào)11種，下調(diào)14種）、24小時（上調(diào)10種，下調(diào)26種）和72小時（上調(diào)32種，下調(diào)25種）暴露于冷處理時鑒定出25、36和57種DAMs。通過韋恩圖來展示兩種物種之間不同和共有的代謝物（圖2D）。結(jié)果顯示，物種內(nèi)共同積累的代謝物數(shù)量較多，物種間代謝物積累模式存在顯著差異。綜合這些數(shù)據(jù)表明，宜昌橙和HB柚子對低溫的反應表現(xiàn)出不同的代謝物積累模式，可能與它們不同的耐寒能力有關。利用k-means聚類算法將372種差異積累的代謝物分為12個不同的聚類(圖2E)。對12個聚類的分析表明，兩種柑橘(2類)的冷脅迫誘導的代謝物主要由糖和醇組成，這些代謝物在植物的非生物脅迫反應中起著至關重要的作用，突出了它們作為保守的應激反應代謝物的重要性。冷處理的宜昌木瓜中有三類特定代謝物(3,4和10類)的大量積累，而在HB柚中沒有觀察到明顯的變化。其中，脂質(zhì)(鞘脂、溶磷脂酰膽堿(LPC)、溶磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰膽堿(PC))、氨基酸及其衍生物(苯丙氨酸、酪氨酸等)、核苷酸及其衍生物(胞苷、8-羥基鳥苷等)和3種黃酮類(野柳葉素、橘皮素、紫葉黃素)在冷處理下特異性積累，部分脂質(zhì)(游離脂肪酸)顯著減少。8類代謝物在低溫下顯著增加，而在HB柚中則相反。最后，12類的大多數(shù)代謝物在兩種之間存在顯著差異。具體來說，這類代謝產(chǎn)物在HB柚中被誘導，但在宜昌木瓜中發(fā)生了微小的變化。與HB柚相比，除了典型的應激相關代謝途徑(類黃酮、糖和醇合成、酚酸合成)外，宜昌橙還表現(xiàn)出了與脂質(zhì)、氨基酸和核苷酸代謝相關的dam的特異性和顯著富集。因此，假設這些代謝物的生物合成和代謝的差異賦予了宜昌橙更強的抗寒性。

圖2 宜昌橙與HB柚的差異代謝組分析

3.轉(zhuǎn)錄組分析

對代謝相同樣本進行轉(zhuǎn)錄組檢測分析。PCA顯示，前兩個主成分可以清楚地區(qū)分分析的24個樣本（圖3A）。相關性分析顯示每個處理中的三個生物學重復之間有明顯的相似性，表明數(shù)據(jù)的可靠性和可重復性（圖3B）。兩種基因型在冷脅迫適應反應中涉及的關鍵代謝途徑的轉(zhuǎn)錄重編程的差異分析顯示，宜昌橙中有1102個共同DEGs，在HB柚子中有1861個共同DEGs在低溫條件下。在這些DEGs中，有433個是宜昌橙特有的，而1192個是HB柚子獨有的。KEGG分析顯示，這些物種特異性DEGs主要參與HB柚子中的黃酮類化合物生物合成途徑，而在宜昌橙中，特定基因主要富集在脂質(zhì)代謝、苯丙烷生物合成和氨基酸生物合成途徑中。WGCNA共鑒定出12個共表達模塊（圖3E），宜昌橙中優(yōu)先表達的基因主要包含在紅色和綠色模塊中。模塊-性狀相關性的熱圖（圖3F）表明，紅色模塊中基因的表達與宜昌橙特有的代謝物（包括Nobiletin、Tangeretin和鞘脂類，它們被歸類在上述的類別4中）相關。此外，棕色模塊中的基因與與海藻糖、半乳糖醇、蔗糖和Nystose相關的代謝物表現(xiàn)出相關性，這些也被確定為參與非生物脅迫反應的主要保守化合物。與代謝物積累動態(tài)一致，黑色和綠色模塊中的基因在宜昌橙的冷處理下被誘導。總之，我們的數(shù)據(jù)揭示了代謝物產(chǎn)生與基因表達變化之間的強相關性，表明它們可以用來研究參與冷脅迫反應的關鍵代謝途徑的調(diào)控。

圖3 冷脅迫下宜昌木瓜(YCC)和HB柚(HB)轉(zhuǎn)錄組學的變化

4.鞘氨醇在增強耐寒性中起著關鍵作用

脂質(zhì)是細胞膜的重要組成部分，在冷脅迫下的功能已得到證實。宜昌橙和HB柚子之間脂質(zhì)積累差異較大，作者重點關注鞘氨醇類，包括二氫鞘氨醇和4-羥基鞘氨醇（圖4A）。在鞘氨醇處理的幼苗中檢測到更低的電解質(zhì)泄漏（EL）和丙二醛（MDA），表明維持了更穩(wěn)定的膜系統(tǒng)。這些發(fā)現(xiàn)表明鞘氨醇顯著減輕了冷誘導的傷害。基于WGCNA分析，鑒定了紅色模塊中的三個基因（Cg7g001680、Cg2g009930和Cg7g021070），其中CiSPT，SPT（Cg7g001680）在宜昌橙中的同源基因，顯示出最顯著的轉(zhuǎn)錄豐度（圖4A）。調(diào)控網(wǎng)絡分析顯示SPT與33個與應激相關的轉(zhuǎn)錄因子有強相關性，包括ERF、WRKY、bHLH和其他轉(zhuǎn)錄因子家族（基于WGCNA權重> 0.38）（圖4B），表明SPT在冷響應中發(fā)揮重要作用。

為了探索SPT（Cg7g001680）在耐寒性中的作用，通過VIGS敲低了CiSPT。在冷處理下，與TRV系相比，VIGS系表現(xiàn)出嚴重的水浸和葉片萎蔫癥狀（圖4C）。TRV-CiSPT系的葉綠素熒光和Fv/Fm比率更低，電解質(zhì)泄漏和MDA含量顯著更高（圖4D-G）。向TRV-CiSPT外源供應5 mM鞘氨醇顯著改善了VIGS系的冷敏感表型（圖4C-G）。總的來說，這些結(jié)果進一步證實了CiSPT在鞘氨醇積累和增強耐寒性中發(fā)揮關鍵的積極作用。

圖4 CiSPT基因的沉默降低了宜昌茄子的耐寒性

5.綠原酸(CGA)通過清除活性氧增強抗寒性

對物種特有的和與時間無關的差異表達基因（DEGs）進行了KEGG分析。433個DEGs與宜昌橙的壓力響應途徑有關，包括信號轉(zhuǎn)導、MAPK信號通路、脂質(zhì)代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導和苯丙烷生物合成（圖5A-B）。鑒于苯丙烷途徑在植物壓力響應中的關鍵作用，對兩種物種中與代謝相關的代謝物和基因進行了全面分析。發(fā)現(xiàn)綠原酸（CGA）是一種以前未被識別的參與柑橘冷響應的代謝物（圖5C）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羥化酶（C4H）和4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）是與核心和特殊代謝都相關的關鍵酶，為許多下游代謝物提供前體。羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HCT/HQT）是催化CGA生物合成的酶。冷處理誘導編碼PAL、C4H、4CL和HCT/HQT的基因在宜昌橙中的表達水平遠高于HB柚子。CGA在冷脅迫下顯著誘導，與HB柚子相比，宜昌橙中的含量顯著更高（圖S8）。HB幼苗在冷處理前先用CGA（5 mM）預處理，與未處理的植物相比，外源性CGA的應用顯著提高了HB幼苗的耐寒性。在宜昌橙中通過VIGS抑制CiHCT2（與CGA積累高度相關的HCT（Cg3g004640）同源基因）表達。與TRV對照相比，TRV-CiHCT2系中的CiHCT2轉(zhuǎn)錄豐度顯著降低（圖S10）。同時，VIGS植物的CGA水平顯著低于對照。暴露于冷脅迫（-4℃，8小時）后，TRV-CiHCT2植物表現(xiàn)出比對照更敏感的冷表型，同時電解質(zhì)泄漏和MDA水平顯著更高，葉綠素熒光和Fv/Fm比率更低（圖6A-F）。VIGS系在葉片中的ROS積累量通過DAB和NBT的組織化學染色比TRV對照顯著更多（圖6G-H）。向TRV-CiHCT2植物外源施用CGA在很大程度上恢復了它們的表型和生理指標，以及顯著增加的內(nèi)源性CGA水平（圖6F）。這些結(jié)果表明，CiHCT2的敲低擾亂了CGA的積累和ROS清除，導致耐寒性受損。

圖5 綠原酸(CGA)生物合成途徑的調(diào)控

圖6?基因CiHCT2的沉默降低了宜昌橙的耐寒性

研究結(jié)論

本研究通過對宜昌橙和HB柚子在低溫處理前后的代謝組和轉(zhuǎn)錄組進行分析，揭示了在冷脅迫下顯著積累的共有和基因型特異性代謝物。研究發(fā)現(xiàn)，糖類、黃酮類和不飽和脂肪酸等物質(zhì)在兩種柑橘中均有積累，但宜昌橙中的含量顯著高于HB柚子。此外，宜昌橙還特異性地積累了一些與脂質(zhì)代謝、苯丙烷代謝和氨基酸代謝途徑相關的代謝物，這些物質(zhì)可能在宜昌橙的抗寒性中起到了獨特的作用。同時，宜昌橙中還特異性地高積累了核苷酸及其衍生物、吲哚類和鞘脂類等信號分子類代謝物，這表明宜昌橙可能擁有更為復雜和緊密的信號網(wǎng)絡，通過調(diào)控代謝變化來響應低溫脅迫。結(jié)合代謝組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析，研究揭示了脂質(zhì)代謝和苯丙烷代謝途徑中基因的表達量和代謝物含量與柑橘的抗寒性密切相關。深入分析顯示，在低溫處理下，宜昌橙中的鞘氨醇和綠原酸兩種代謝物大量積累。通過病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術，研究者沉默了宜昌橙中的CiSPT（參與鞘氨醇合成的基因）和CiHCT2（參與綠原酸合成的基因），導致這兩種代謝物的內(nèi)源含量顯著下降，植株的抗寒能力也隨之減弱。然而，當外源添加鞘氨醇和綠原酸時，可以顯著恢復經(jīng)過基因沉默處理的宜昌橙植株的低溫敏感表型。這些結(jié)果進一步證實了CiSPT和CiHCT2在調(diào)控鞘氨醇和綠原酸積累以及增強植株抗寒性中的關鍵作用。