黃烷-3-醇是茶樹幼葉主要多酚類化合物，在茶樹中參與其生物合成的酶已得到了廣泛的研究，然而這些功能酶在細(xì)胞中的定位被忽視。

3月10日，The Plant Journal在線發(fā)表了安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)王云生團(tuán)隊(duì)題為“A flavonoid metaBolon: cytochrome B5 enhances B-ring trihydroxylated flavan-3-ols synthesis in tea plants”的研究成果。文章中利用空間代謝組揭示了B環(huán)三羥 基黃酮類化合物分布模式，通過亞細(xì)胞定位和蛋白互作分析確定了其生物合成途徑中關(guān)鍵酶，本研究為了解茶樹類黃酮多樣性和高效合成機(jī)制提供了有價(jià)值的見解。邁維代謝為其提供空間代謝組檢測與分析服務(wù)。

研究思路：

研究結(jié)果：

1.類黃酮在茶樹中的積累規(guī)律

為研究黃酮類化合物分布規(guī)律測定了不同品種（舒茶早、黃金芽、紫鵑茶）不同組織（芽、幼葉、成熟葉、老葉、幼根、幼莖）中黃烷-3-醇、黃酮醇、花青素和原花青素（PAs）含量。老葉中黃烷-3-醇的含量明顯低于幼葉。此外，SCZ幼葉中黃烷-3-醇含量顯著高于HJY和ZJ。黃酮醇及其衍生物主要在老葉中積累，花青素主要在ZJ葉中積累。可溶性PAs在葉片中的積累濃度為不溶性PAs 10倍，可溶性PAs主要積累在莖中，不溶性PAs主要積累在幼根中。綜上所述，茶樹在不同組織中積累多種黃酮，以黃烷-3-醇為主要成分。

茶樹中類黃酮積累概況

2.不同B環(huán)羥 基黃烷-3-醇含量和空間分布變化

對不同葉片顏色茶樹芽進(jìn)行黃烷-3-醇分析，SCZ、HJY和ZJ普遍存在B環(huán)三羥 基黃烷-3-醇，且為最豐富的黃酮。隨后，檢測了各種羥 基黃酮類化合物在茶樹芽切片中的空間分布。類黃酮在茶樹芽中的分布不同，原花青素B2/B3（PAs B2/B3，m/z = 577.1313）在芽內(nèi)層表現(xiàn)出更強(qiáng)的信號，B環(huán)三羥 基化合物主要存在于芽的外層。

不同B環(huán)羥 基化合物在芽中的空間分布

3.與類黃酮途徑相關(guān)的基因表達(dá)

文中檢測了芽、幼葉、成熟葉、老葉、幼莖和幼根中11個類黃酮生物合成酶基因。CsC4H在幼葉和根中表達(dá)水平相對較高。芽和幼葉轉(zhuǎn)錄水平最高，并隨著葉片成熟逐漸降低，幼根和老葉的轉(zhuǎn)錄水平最低。CsF3’5’H在芽中的表達(dá)量最高，在老葉中很低。

4.類黃酮途徑酶的亞細(xì)胞定位

本研究探討了與類黃酮代謝途徑相關(guān)酶的定位。CsC4H、CsF3’H和CsF3’5’H被歸入細(xì)胞色素P450家族，這些酶可能存在跨膜結(jié)構(gòu)域。為驗(yàn)證這些類黃酮P450酶的胞內(nèi)定位，文章利用綠色熒光蛋白（GFP）在本氏煙草葉表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)以確定這些酶定位結(jié)果。結(jié)果顯示參與類黃酮生物合成的酶（CsCHS、CsCHI、CsF3H和CsDFR）表現(xiàn)出典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號，表明它們可能與細(xì)胞色素P450的聯(lián)系更為密切。

類黃酮途徑酶亞細(xì)胞定位結(jié)果

5.類黃酮途徑P450酶互作關(guān)系

通過泛素酵母雙雜交（SU-Y2H）和熒光素酶蛋白互作分析(Split-LUC) 研究了CsC4H、CsF3’H和CsF3’5’H的潛在相互作用，結(jié)果顯示CsC4H、CsF3’H和CsF3’5’H之間沒有直接的相互作用，CsF3’5’H蛋白C端參與了黃烷-3-醇代謝物的形成。結(jié)合SU-Y2H和split-LUC結(jié)果證實(shí)這三種P450酶在體內(nèi)相互關(guān)聯(lián)，但似乎在物理上沒有相互作用。

類黃酮途徑蛋白空間鄰近性及相關(guān)性

6.與類黃酮可溶性酶相互作用的P450酶

文中進(jìn)一步研究了三種P450酶與代謝物形成相關(guān)可溶性蛋白的互作關(guān)系。類黃酮生物合成P450（CsC4H和CsF3’H）可以與除CsLAR外的大多數(shù)可溶性酶發(fā)生物理相互作用。然而，合成B環(huán)三羥 基黃烷-3-醇的P450酶CsF3’5’H僅與上游酶（CsCHS、CsCHI和CsF3H）存在空間關(guān)聯(lián)，沒有直接相互作用。

煙草葉片中P450酶與類黃酮途徑可溶性酶空間位置關(guān)系

7.細(xì)胞色素B5與P450物理相互作用并支持CsF3’5’H催化能力

接下來，文中通過SU-Y2H和split-LUC方法評估了P450和三種CsCB5之間的相互作用。結(jié)果顯示，CsCB5A、CsCB5B和CsCB5C直接與CsC4H、CsF3’H和CsF3’5’H相互作用，CsCB5C和CsF3’5’H的?-半乳糖苷酶活性明顯強(qiáng)于其他2種CsCB5s。在WAT11酵母菌株中進(jìn)行了CsCB5s和P450s異源共表達(dá)，結(jié)果表明CsC4H和CsF3’H催化活性并不依賴于CsCB5蛋白。另外研究表明CsCB5C是CsF3’H催化反應(yīng)不可或缺的合作伙伴，提高了CsF3’H在合成相應(yīng)產(chǎn)物中的催化活性。

CsCB5蛋白與類黃酮生物合成途徑P450酶的關(guān)系

8.CsCB5C是類黃酮合成的電子穿梭蛋白

文中用丙氨酸（Ala）取代一個或兩個保守的組氨酸殘基（His-39和His-73），生成位點(diǎn)突變的CB5C（CsCB5C-CΔ1、CsCB5C-Δ2和CsCB5C-Δ1Δ2）。SU-Y2H結(jié)果顯示，組氨酸殘基突變不會降低CsF3’5’H物理結(jié)合能力。在酵母菌株WAT11中共表達(dá)CsCB5C-CΔ1、CsCB5C-Δ2或CsCB5C-Δ1Δ2，結(jié)果表明，CsCB5C中兩個組氨酸殘基作為電子載體的性質(zhì)非常重要，影響了CsF3’5’H催化活性。

CsCB5C蛋白影響CsF3’5’H催化活性的關(guān)鍵位點(diǎn)

研究結(jié)論：

文中評估了茶樹類黃酮途徑中主要功能酶與不同程度B環(huán)羥 基化物質(zhì)的關(guān)系。此外，構(gòu)建了一個ER代謝模型，該模型由CsC4H和CsF3’H串聯(lián)組成，CsCPR作為電子供體蛋白以產(chǎn)生B環(huán)二羥 基黃酮類化合物。幾種可溶性酶通過弱力附著在P450酶的細(xì)胞質(zhì)表面。這些可溶性酶之間的相互作用可以調(diào)節(jié)不同代謝途徑的代謝產(chǎn)物。在CsF3’5’H的參與下，上游產(chǎn)物被催化為B環(huán)三羥 基中間產(chǎn)物，然后通過可溶性酶產(chǎn)生各種下游類黃酮化合物。

山茶中類黃酮生物合成模型。

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